① 课题来源与背景；肠道菌群常被称为人体中存在的第九大系统以及第二大基因组，肠道中所存在的各种细菌的总含量已经超过了人体的总细胞量，被认为人体的另一个"器官"。肠道菌群可通过影响能量代谢、炎症反应、促进或抑制肿瘤细胞增殖分化，对心血管疾病、抑郁症、糖尿病、免疫疾病、结直肠癌、肝硬化等的发生发展产生直接或间接的影响[5]。成熟稳定的肠道菌群可以增加肠粘膜稳定性，其协助人体能量摄取与代谢，提升免疫系统的发展与成熟等，肠道菌群失衡的则可以导致诸多健康问题。作为肠道菌群中主要组成部分，拟杆菌是目前报道较多的与疾病相关的关键细菌。VI型分泌系统（T6SS）是编码于多种革兰氏阴性细菌中的蛋白质分泌装置，其可将效应蛋白直接转移到靶细胞中。拟杆菌在人体肠道组成中的关键性和与疾病的关联性都提示，深入研究该菌属的功能将有助于我们更好的利用该菌属。然而目前国际上对于拟杆菌的研究大部分集中在菌群研究和生物信息学相关性和代谢研究。对于其分子学和功能学研究较好的团队包括;耶鲁大学Andrew Goodman教授团队、哈佛医学院Laurie Comstock 教授团队及华盛顿大学Joseph D Mougous教授团队等。而国内尚无针对拟杆菌进行分子学及功能学研究团队。 ② 研究目的与意义：本研究的首要目的在于建立一个拟杆菌培养、筛选及分子学操作和功能研究平台，并在此基础上深入探索拟杆菌T6SS在肠道菌群生态稳定性的影响。该平台的建立将有助于我们在多种疾病与拟杆菌相关性研究中的可操作性。从而进一步掌握利用肠道菌去改善肠道菌群的稳态从而预防和治疗疾病。 ③ 主要论点与论据；利用收集到的205个拟杆菌基因组，最终筛选到了114个编码T6SS的基因簇。最终对拟杆菌T6SS结果显示GA2 与GA3 T6SS基因簇的ORF结构进行了系统分析。我们利用pLGB13自杀质粒介导的重组系统，成功构建了拟杆菌B.fragilis、B.caccae及B.uniformis的T6SS突变株。利用生物信息学方法在52个具有完整结构的GA2 T6SS中预测潜在的效应蛋白。与GA3 T6SS不同的是，GA2 T6SS编码了广泛而多样的效应蛋白，一个GA2 T6SS最多时可同时编码效应蛋白。其效应蛋白编码位置也不仅限于可变区，而是包括了Rhs、 eTssD（eHcp）等C末端多样性毒性分子。随后，将V1区和V2区效应蛋白基因分别单独或与免疫蛋白一同克隆到pNBU2-erm- GH023表达质粒上，同时在效应蛋白N末端融合信号序列或不融合信号序列。最终鉴定出了4种效应蛋白-免疫蛋白对。我们利用实验室自行制备的TssD蛋白抗血清对拟杆菌代表菌的上清和沉淀进行了Western blot检测，结果显示GA3 T6SS在BHIS培养基培养条件下可正常表达且可分泌至上清中，当T6SS核心基因被删除后，其TssD蛋白仍可被合成，但无法分泌至上清中。体外拮抗实验进一步证实了以上结果。说明GA2 T6SS无法在正常情况下介导细菌间的拮抗。我们利用Biolog实验对GA2 T6SS分泌的诱导因素进行了初步的筛选。Dot blot检测结果显示，当在M9培养基中以Mucin为碳源时可在上清中检测到明显的TssD的分泌。我们将野生株与突变株按1:1的比例进行混合后给小鼠灌胃。七天后我们取小鼠粪便稀释涂筛选平板后PCR鉴定菌落，最终确定菌落百分比GA3 T6SS野生株在肠道中对拟杆菌突变株有显著的拮抗作用。而GA2 T6SS野生株在肠道中也表现出了一定的拮抗活性，说明T6SS在肠道生态环境中与拟杆菌的定殖与丰度有直接相关性。 ④ 创见与创新；肠道拟杆菌中的T6SS是近几年才被人们发现，因此，目前国内外对于拟杆菌肠道T6SS的研究非常少。也尚未有任何对于拟杆菌T6SS与肠道菌群生态相关的功能学研究报道。因此，本项研究具有很好的创新性和先进性。 ⑤ 社会经济效益，存在的问题；本研究属于基础研究，其向实用性转化仍有距离。但其对菌群生态研究，尤其是肠道菌群之间的互作及机制的探索等具有较好的参考价值。